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本書首先介紹CRISPR/Cas系統(tǒng)的起源和基本原理，在此基礎(chǔ)上詳細(xì)介紹CRISPR/Cas技術(shù)與病原體檢測、CRISPR/Cas技術(shù)與耐藥檢測、CRISPR/Cas技術(shù)與腫瘤檢測、CRISPR/Cas技術(shù)與非傳染病原體檢測、CRISPR/Cas技術(shù)與小分子檢測，CRISPR/Cas技術(shù)與新冠病毒突變株檢測以及CRISPR/Cas現(xiàn)存的技術(shù)瓶頸及可能的解決方案等。作為一本涵蓋CRISPR理論和應(yīng)用技術(shù)的工具書，將全面反映CRISPR/Cas技術(shù)的國內(nèi)外最新進(jìn)展；并詳細(xì)介紹相關(guān)技術(shù)操作細(xì)節(jié)和方法，力求使零基礎(chǔ)讀者能借此獨(dú)立開展實驗設(shè)計和操作，并取得預(yù)期實驗結(jié)果，促進(jìn)新技術(shù)推廣和產(chǎn)業(yè)化。

CRISPR/Cas 技術(shù)的創(chuàng)新發(fā)展推動生命科學(xué)研究進(jìn)入了劃時代的新階段。CRISPR/Cas 基因編輯技術(shù)用于腫瘤和遺傳病等難以治愈疾病的治療，創(chuàng)建了基因治療新方法。法國科學(xué)家卡彭蒂耶和美國科學(xué)家杜徳娜在CRISPR/Cas 研究與應(yīng)用領(lǐng)域做出了杰出貢獻(xiàn)，被授予2020 年諾貝爾化學(xué)獎。
CRISPR/Cas 技術(shù)在分子診斷領(lǐng)域展現(xiàn)了巨大潛力，是繼聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)之后，備受關(guān)注的又一個里程碑，已廣泛應(yīng)用于感染性和非感染性疾病的篩查與診斷。2018 年，Science 雜志將CRISPR/Cas 分子診斷技術(shù)稱為新一代分子診斷方法。2022 年，Nature 雜志將CRISPR/Cas 分子診斷技術(shù)列為當(dāng)年最值得關(guān)注的七項技術(shù)之一。
為了適應(yīng)國際前沿技術(shù)發(fā)展，積極普及生物診斷新知識、推廣新技術(shù)，促進(jìn)產(chǎn)業(yè)化快速發(fā)展，中國醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會生物診斷技術(shù)分會在時任主任委員李銀太教授的主持下，組織相關(guān)專家歷經(jīng)兩年多時間編寫了《CRISPR 分子診斷技術(shù)原理及應(yīng)用》一書。全書分上、中、下三篇，系統(tǒng)介紹了CRISPR 分子診斷技術(shù)原理、技術(shù)方法及在生物診斷領(lǐng)域應(yīng)用的最新進(jìn)展。此外還介紹了一種具備核酸內(nèi)切酶活性的Argonaute 核酸酶及其在分子診斷中的應(yīng)用。
本書既注重描述CRISPR 相關(guān)技術(shù)基本原理，又比較詳細(xì)介紹了實驗方法及設(shè)計理念，并提供了系列分子診斷實例，期望能為讀者提供具有參考價值的理論知識和操作指南。由于該前沿技術(shù)發(fā)展日新月異，新方法和新應(yīng)用不斷涌現(xiàn)，難免掛一漏萬，敬請讀者諒解。
在此，謹(jǐn)代表中國醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會生物診斷技術(shù)分會，對所有為本書編輯問世做出貢獻(xiàn)的專家和同道表示衷心感謝！
中國醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會生物診斷技術(shù)分會主任委員
李越希
2024 年10 月于南京

緒論/1
一、CRISPR/Cas系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)/1
二、CRISPR/Cas系統(tǒng)的組成與分類/2
三、CRISPR/Cas系統(tǒng)在分子診斷中的應(yīng)用/3
四、CRISPR分子診斷技術(shù)的研究熱點(diǎn)及發(fā)展方向/4
上篇CRISPR分子診斷技術(shù)
第一章CRISPR/Cas蛋白作用原理與應(yīng)用/8
第一節(jié)CRISPR/Cas蛋白分類與功能/8
一、1類CRISPR/Cas蛋白/9
二、2類CRISPR/Cas蛋白/10
第二節(jié)CRISPR分子診斷技術(shù)應(yīng)用/15
一、CRISPR分子診斷技術(shù)工作原理/15
二、CRISPR分子診斷體系/18
第二章CRISPR技術(shù)與核酸現(xiàn)場快速檢測/27
第一節(jié)智能手機(jī)CRISPR技術(shù)/27
一、技術(shù)原理/27
二、技術(shù)方法/29
第二節(jié)基于環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增/側(cè)向流層析的CRISPR技術(shù)/31
一、技術(shù)原理/31
二、技術(shù)方法/31
第三節(jié)基于重組酶聚合酶恒溫擴(kuò)增/側(cè)向流層析的CRISPR技術(shù)/32
一、技術(shù)原理/32
二、技術(shù)方法/33
第四節(jié)可穿戴的CRISPR診斷裝備/34
一、技術(shù)原理/34
二、技術(shù)方法/35
第五節(jié)CRISPR分子診斷一體機(jī)快檢系統(tǒng)/36
一、SmartRanger一體機(jī)/36
二、BG-Nova-X8一體機(jī)/37
第三章CRISPR多重檢測技術(shù)/40
第一節(jié)單管多重CRISPR分子檢測/40
一、單管四重CRISPR分子檢測/40
二、單管雙重CRISPR分子檢測/41
三、恒溫擴(kuò)增聯(lián)合CRISPR分子雙重檢測/42
第二節(jié)多反應(yīng)容器多重CRISPR分子檢測/43
一、基于并聯(lián)反應(yīng)管的多重CRISPR分子檢測/43
二、微流控多重CRISPR分子檢測平臺/44
三、紙基微流控多重CRISPR分子檢測/44
四、全自動多重CRISPR分子檢測/45
五、CARMEN微流控CRISPR分子檢測平臺/45
第四章免核酸擴(kuò)增CRISPR分子診斷/48
第一節(jié)免核酸擴(kuò)增檢測技術(shù)/48
一、Cas9免核酸擴(kuò)增檢測/48
二、Cas12免核酸擴(kuò)增檢測/51
三、Cas13免核酸擴(kuò)增檢測/54
四、多重CRISPR/Cas系統(tǒng)級聯(lián)法檢測/59
第二節(jié)免核酸擴(kuò)增CRISPR分子診斷技術(shù)的應(yīng)用/61
一、液滴微流控定量檢測方法/61
二、多條crRNA聯(lián)合檢測/63
三、基于納米金探針的免核酸擴(kuò)增檢測/65
第五章CRISPR分子診斷系統(tǒng)信號輸出/69
第一節(jié)檢測信號輸出方式/69
一、光學(xué)信號/69
二、電化學(xué)信號/73
三、側(cè)向流層析試紙條顯色/74
四、其他信號輸出方式/74
第二節(jié)CRISPR分子信標(biāo)系統(tǒng)/75
第六章CRISPR非核酸靶標(biāo)檢測技術(shù)/84
第一節(jié)離子檢測/85
第二節(jié)小分子化合物檢測/87
一、ATP檢測/87
二、抗生素檢測/90
三、代謝物檢測/90
四、三聚氰胺檢測/91
五、毒物檢測/91
第三節(jié)多糖檢測/91
第四節(jié)蛋白質(zhì)檢測/92
一、多肽檢測/92
二、蛋白標(biāo)志物檢測/94
三、干擾素檢測/96
四、蛋白酶檢測/96
五、酶活性檢測/97
第五節(jié)細(xì)胞檢測/98
第六節(jié)轉(zhuǎn)錄因子檢測/100
中篇CRISPR分子診斷技術(shù)應(yīng)用
第七章病原微生物檢測/106
第一節(jié)李斯特菌檢測/107
一、技術(shù)原理/107
二、技術(shù)方法/108
第二節(jié)結(jié)核分枝桿菌檢測/109
一、技術(shù)原理/109
二、技術(shù)方法/110
第三節(jié)炭疽桿菌檢測/111
一、技術(shù)原理/111
二、技術(shù)方法/112
第四節(jié)煙曲霉檢測/114
一、技術(shù)原理/114
二、技術(shù)方法/114
第八章病毒變異檢測與分型/116
第一節(jié)SARS-CoV-2變異株檢測/116
一、SARS-CoV-2變異株/116
二、基于CRISPR/Cas技術(shù)的SARS-CoV-2變異株檢測/119
三、重組酶輔助擴(kuò)增#NAME?快速檢測SARS-CoV-2Omicron
變異體/127
第二節(jié)寨卡病毒檢測及分型/134
一、寨卡病毒制備與處理/135
二、NASBA反應(yīng)/135
三、NASBACC反應(yīng)/135
第九章特殊病原體檢測/139
第一節(jié)支原體檢測/139
一、肺炎支原體檢測/139
二、人型支原體檢測/140
第二節(jié)螺旋體檢測/142
第三節(jié)諾卡菌檢測/143
一、鼻疽諾卡菌檢測/143
二、蓋爾森基興諾卡菌檢測/144
第十章腫瘤診斷/147
第一節(jié)DNA點(diǎn)突變檢測/147
一、依賴PAM的單核苷酸差異檢測/147
二、不依賴PAM的罕見點(diǎn)突變檢測/148
第二節(jié)DNA甲基化檢測/150
一、技術(shù)原理/151
二、技術(shù)方法/151
第三節(jié)腫瘤微小RNA檢測/152
一、基于Cas9的微小RNA檢測/152
二、基于Cas12a的微小RNA檢測/153
第四節(jié)腫瘤蛋白標(biāo)志物檢測/154
一、技術(shù)原理/155
二、技術(shù)方法/155
第十一章非感染性疾病診斷/158
第一節(jié)CRISPR檢測趨化因子配體mRNA/158
一、技術(shù)原理/158
二、技術(shù)方法/159
第二節(jié)CRISPR-FISH檢測線粒體DNA突變/159
一、技術(shù)原理/159
二、技術(shù)方法/160
第三節(jié)CRISPR-層析技術(shù)檢測DNA缺失突變/164
一、技術(shù)原理/164
二、技術(shù)方法/164
第四節(jié)CRISPR-酶聯(lián)免疫吸附試驗/165
一、技術(shù)原理/165
二、技術(shù)方法/166
第五節(jié)CPISPR-鏈置換擴(kuò)增檢測/167
一、技術(shù)原理/167
二、技術(shù)方法/169
第六節(jié)CRISPR-適配體傳感器/171
一、技術(shù)原理/171
二、技術(shù)方法/171
第十二章耐藥基因檢測/176
第一節(jié)-內(nèi)酰胺類耐藥基因檢測/176
一、技術(shù)原理/176
二、技術(shù)方法/177
三、技術(shù)特點(diǎn)/178
第二節(jié)氨基糖苷類耐藥基因檢測/179
一、技術(shù)原理/179
二、技術(shù)方法/180
三、技術(shù)特點(diǎn)/180
第三節(jié)乙型肝炎病毒拉米夫定耐藥基因檢測/181
一、技術(shù)原理/181
二、技術(shù)方法/182
三、技術(shù)特點(diǎn)/183
第四節(jié)流行性感冒病毒奧司他韋耐藥基因檢測/183
一、技術(shù)原理/183
二、技術(shù)方法/184
三、技術(shù)特點(diǎn)/185
第五節(jié)瘧原蟲磺胺多辛耐藥基因檢測/185
一、技術(shù)原理/185
二、技術(shù)方法/186
三、技術(shù)特點(diǎn)/187
第六節(jié)肺癌靶向藥物表皮生長因子受體耐藥基因檢測/188
一、技術(shù)原理/188
二、技術(shù)方法/189
三、技術(shù)特點(diǎn)/190
第七節(jié)急性髓系白血病靶向藥物FLT3耐藥基因檢測/190
一、技術(shù)原理/190
二、技術(shù)方法/191
三、技術(shù)特點(diǎn)/192
第十三章食品安全檢測/195
第一節(jié)核酸靶標(biāo)檢測/195
一、CRISPR-光熱可視化雙模式檢測/206
二、CRISPR-G四聯(lián)體耦合技術(shù)的智能手機(jī)檢測/208
三、CRISPR-表面增強(qiáng)拉曼散射微流控檢測/211
四、CRISPR-表面增強(qiáng)拉曼散射可視化檢測/213
五、CRISPR快速鑒別清真食品/215
第二節(jié)非核酸靶標(biāo)檢測/217
一、CRISPR-適配體傳感器檢測ATP/221
二、CRISPR-上轉(zhuǎn)發(fā)光生物傳感器/222
三、CRISPR-納米鏈級聯(lián)熒光適配傳感器/224
下篇Argonaute分子診斷系統(tǒng)
第十四章Argonaute核酸酶/232
第一節(jié)Ago分類系統(tǒng)/232
一、Ago分子進(jìn)化/232
二、Ago結(jié)構(gòu)特征/233
第二節(jié)Ago催化活性與生物學(xué)功能/236
一、核酸酶活性/236
二、生物學(xué)功能/236
第三節(jié)Ago催化機(jī)制/238
一、依賴引導(dǎo)鏈剪切/238
二、不依賴引導(dǎo)鏈剪切/239
三、堿基錯配對剪切的影響/239
四、引導(dǎo)鏈的5端修飾對剪切的影響/240
第四節(jié)Ago基因編輯與核酸檢測/240
一、Ago基因編輯/240
二、Ago核酸檢測/241
三、Ago成像技術(shù)/249
第十五章Ago檢測腫瘤及遺傳病低豐度基因/254
第一節(jié)技術(shù)原理/255
第二節(jié)技術(shù)方法/255
第三節(jié)技術(shù)特點(diǎn)/260
第十六章Ago檢測病原體核酸/262
第一節(jié)技術(shù)原理/262
第二節(jié)技術(shù)方法/264
第三節(jié)技術(shù)特點(diǎn)/270

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