《國家級實驗示范中心配套教材：微生物學實驗》共分八章，第一章介紹微生物的個體形態(tài)觀察；第二章為微生物的分離和純培養(yǎng)；第三章為微生物的生長和數(shù) 量的測定；第四章為微生物的生理生化反應：第五章為微生物的遺傳與育種；第六章為細菌的血清學鑒定：第七章為分子微生物學基礎；第八章為應用微生物學實 驗，總計61個實驗。最后為附錄，包括常用微生物名稱、常用培養(yǎng)基配方、常用試劑和溶液的配制、常用染色液和配制等。
《國家級實驗示范中心配套教材：微生物學實驗》為大學本科微生物學實驗教材，供高等學校生物科學、生物技術、生物工程、發(fā)酵工程、植物科學和生產類各專業(yè)學生及科研、生產單位相關人員參考。
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楊民和主編的《微生物學實驗》內容介紹：本書共分8章61個實驗，包括：微生物的形態(tài)觀察、分離和純培養(yǎng)、生長和數(shù)量的測定、生理生化反應、遺傳與育種、血清學鑒定、分子微生物學和應用微生物學等。每個實驗列出實驗原理、目的要求、實驗器材、方法和步驟、結果與分析、注意事項和思考題等內容。書后有附錄和參考資料。
第一章 微生物的個體形態(tài)觀察
實驗1 細菌的簡單染色及形態(tài)觀察
【實驗原理】
細菌菌體微小且透明，在光學顯微鏡下，特別是在油鏡下，菌體與背景沒有顯著的明暗差，很難看清菌體形態(tài)。若菌體染色，則菌體折光率增大，其形態(tài)易于觀察。
細菌染色的染料是一類苯環(huán)上含有發(fā)色基團和助色基團的化合物。發(fā)色基團使化合物具有染色能力；助色基團有電離特性，可以與被染物結合，使被染物著色。染色的染料分為堿性染料、酸性染料和中性染料三大類。堿性染料帶正電荷，能和帶負電荷的物質結合。因細菌蛋白的等電點較低，當它生長于中性、堿性或弱酸性的溶液中時常帶負電荷，所以通常采用美藍、結晶紫、堿性復紅或孔雀綠等堿性染料使其著色。酸性染料帶負電荷，能與帶正電荷的物質結合。當細菌分解糖類產酸使培養(yǎng)基pH下降時，細菌所帶正電荷增加，易被伊紅、剛果紅或酸性復紅等酸性染料著色。中性染料又稱復合染料，是前兩類染料的結合物，如伊紅美藍、伊紅天青等。
簡單染色法是利用單一染料對細菌進行染色以顯示其形態(tài)的一種方法。
該方法操作簡便，適于觀察細菌的一般形狀及排列，但不能辨別細菌細胞的構造。
【實驗目的和要求】
1.了解簡單染色法的基本原理，并掌握其操作方法；
2.掌握油鏡的使用及無菌操作技術；
3.初步認識細菌的形態(tài)特征。
【實驗器材】
1.菌種大腸桿菌（Escherichiacoli）、金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）。
2.染色液堿性美藍染液、結晶紫染液。
3.器材顯微鏡、酒精燈、載玻片、接種環(huán)、香柏油、二甲苯、生理鹽水、擦鏡紙等。
【實驗方法與步驟】
簡單染色法的基本程序如下：涂片干燥固定染色水洗干燥鏡檢
1.涂片在干凈的載玻片中央滴加一小滴生理鹽水或用接種環(huán)挑3或4環(huán)生理鹽水，然后在無菌操作條件下，用接種環(huán)從斜面上挑取少量菌種于載玻片上的生理鹽水中，混勻并涂成薄膜，涂布面積為1～1.5cm2。
2.干燥涂片可以放在空氣中自然干燥；若要使干燥速度加快，可在酒精燈上方加溫，但勿緊靠火焰。
3.固定待涂片干燥后，手持涂片一端，有菌膜的一面向上，在酒精燈火焰上通過2或3次，待冷卻后，再加染料。
4.染色將涂片水平放置，在菌膜部位滴加染色液（以恰好覆蓋菌膜為宜），染色1～2min。
5.水洗傾去染液，斜置涂片，用細水流的自來水沖洗（切勿用自來水直接沖洗菌膜部位），直至洗下水呈無色為止。
6.干燥將水洗的涂片放在空氣中晾干或用吸水紙吸干，注意不要擦撩菌體。
7.鏡檢待涂片干燥后，先用低倍鏡觀察，再用高倍鏡觀察，找出適當?shù)囊曇昂螅瑢⒏弑剁R轉出，在菌膜部位上加香柏油一滴，然后將油鏡頭浸入油滴中仔細調焦觀察細菌的形態(tài)。鏡檢完成后，用擦鏡紙滴加二甲苯1～2滴，擦干凈油鏡鏡頭上殘留的香柏油，保持鏡頭的干凈。
【結果與分析】
繪制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的菌體形態(tài)圖。
【注意事項】
1.涂片時，生理鹽水及菌體不宜過多，涂片要均勻，不宜過厚。
2.水洗時，水流不宜過大、過急，以免涂片薄膜脫落。
3.熱固定時溫度不宜過高（以玻片背面不燙手為宜），否則會改變甚至破壞細胞形態(tài)。
【思考題】
1.為什么染色前需要進行菌體固定？
2.為什么固定時只能微加熱？若加熱溫度過高、時間過長，會出現(xiàn)什么問題？
3.為什么要待涂片完全干燥后才能使用油鏡進行觀察?
4.為什么鏡檢完成后必須清除殘留在油鏡鏡頭上的香柏油？
實驗2細菌的革蘭氏染色法
【實驗原理】
革蘭氏染色反應是細菌分類和鑒定的一個重要特征，它是1884年由丹麥醫(yī)生C.Gram創(chuàng)立的。革蘭氏染色法（Gramstain）不僅能觀察到細菌的形態(tài)，而且還可將細菌分為染色反應呈藍紫色的革蘭氏陽性（G+）菌，染色反應呈紅色的革蘭氏陰性（G?）菌。細菌對于革蘭氏染色的不同反應，是由它們細胞壁的成分和結構不同而造成的。革蘭氏陽性菌的細胞壁主要是由肽聚糖形成的網(wǎng)狀結構組成的，在染色過程中，當用乙醇處理時，由脫水而引起網(wǎng)狀結構中的孔徑變小，通透性降低，使結晶紫-碘復合物被保留在細胞內而不易脫色，因此，呈現(xiàn)藍紫色；革蘭氏陰性菌的細胞壁中肽聚糖含量低，而脂類物質含量高，當用乙醇處理時，脂類物質溶解，細胞壁的通透性增加，使結晶紫-碘復合物易被乙醇抽出而脫色，然后又被染上了復染液（番紅）的顏色，因此呈現(xiàn)紅色。
【實驗目的和要求】
1.了解革蘭氏染色法的原理及其在細菌分類鑒定中的重要性；
2.掌握革蘭氏染色方法。
【實驗器材】
1.菌種培養(yǎng)18～24h的大腸桿菌（Escherichiacoli）、金黃色葡萄球菌（Staphyloccocusaureus）、待測菌一種。
2.藥品乙二酸銨結晶紫染液、盧戈氏（Lugol）碘液、95%乙醇、番紅復染液、無菌水。
3.用具載玻片、接種環(huán)、鑷子、酒精燈、火柴、洗瓶、廢液缸、吸水紙、顯微鏡等。
【實驗方法與步驟】
1.涂片將培養(yǎng)18～24h的3種菌分別用接種環(huán)涂3條帶于清潔載玻片上（注意涂片不宜過厚），風干、固定（通過火焰1或2次即可，不可過熱，以載玻片不燙手為宜）。
2.染色
（1）初染：滴加乙二酸銨結晶紫染液覆蓋涂菌帶，染色1～2min，水洗至洗出液無色。
（2）媒染：滴加盧戈氏碘液沖去殘水，并覆蓋約1.0min，水洗至洗出液無色。
（3）脫色：將載玻片上面的水用吸水紙吸干，在白色背景下滴加95%乙醇洗至洗出液無色時（20～30s），立即用水洗去乙醇，用吸水紙吸干。
（4）復染：用復染劑（番紅）染色10s，水洗。
（5）鏡檢：吸干或風干后，油鏡觀察。
【結果與分析】
實驗結果革蘭氏陰性菌呈紅色，革蘭氏陽性菌呈紫色。檢視實驗中3種菌各染成什么顏色？它們是革蘭氏陰性菌還是革蘭氏陽性菌？將實驗結果記錄在表2-1中。
【注意事項】
1.染液要求新配制，放置時間不宜過長，盧戈氏碘液易褪色失效，必須裝在棕色試劑瓶內并放于暗處保存。
2.革蘭氏染色的關鍵在于嚴格掌握95%乙醇脫色程度，如脫色過度，則陽性菌可被誤染為陰性菌；而脫色不夠時，陰性菌可被誤染為陽性菌，因此脫色時間一定要把握好。
3.菌齡也影響染色結果，如陽性菌培養(yǎng)時間過長，或已死亡及部分菌已自行溶解，都常呈陰性反應，因此一定要確保實驗菌的菌齡。
【思考題】
1.革蘭氏染色中涂片為什么不宜過厚？染色成敗的關鍵步驟是哪一步？
2.對未知菌種進行革蘭氏染色時，如何保證染色技術操作正確、結果可靠？
實驗3細菌的芽孢染色
【實驗原理】
芽孢為某些細菌細胞在不良的環(huán)境條件下產生的休眠體，芽孢壁厚、透性低、不易著色，而一旦染上顏色以后難以脫色。
芽孢染色主要是利用不同的染料進行染色，使芽孢和營養(yǎng)體呈不同的顏色。
在加熱條件下，用著色力強的染料對芽孢進行染色，菌體也會著色，然后水洗，芽孢染上的顏色難以被洗脫，而菌體會脫色。然后用對比度大的復染劑對菌體染色，菌體染上復染劑顏色，芽孢仍為原來的顏色，因而能更明顯地襯托出芽孢，便于觀察。
【實驗目的和要求】
1.學習并掌握細菌的芽孢染色法；
2.了解并觀察細菌芽孢的結構和形態(tài)。
【實驗器材】
1.菌種枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、生孢梭菌（Clostridium sporogenes），在適宜的生長溫度下培養(yǎng)20h。
2.藥品5%孔雀綠水溶液、0.5%番紅水溶液、二甲苯、香柏油、蒸餾水、95%乙醇。
3.用具顯微鏡、接種環(huán)、酒精燈、載玻片、擦鏡紙、吸水紙等。
【實驗方法與步驟】
1.制片取清潔載玻片，在中央滴一滴蒸餾水，用接種環(huán)無菌操作從枯草芽孢桿菌斜面上挑一環(huán)菌置于載玻片液滴上，小液滴呈混濁狀即可，并按常規(guī)方法干燥、固定（每隔幾秒在酒精燈火焰上過一次）。
2.加熱染色往載玻片滴加數(shù)滴5%孔雀綠水溶液覆蓋涂菌部位，用夾子夾住載玻片在微火上加熱至染液冒蒸汽（此時計時）并維持5.0min，加熱時注意補充染液，勿讓涂片干涸。
3.脫色待玻片冷卻后，用緩流自來水沖洗至流出水無色為止。
4.復染用0.5%的番紅水溶液復染1.5～2.0min。
5.水洗用緩流自來水沖洗至流出水無色為止。
6.鏡檢待載玻片自然干燥后（可在酒精燈火焰上每隔幾秒過一次）油鏡鏡檢，觀察芽孢的形態(tài)。
【結果與分析】
按表3-1記錄實驗結果。
【注意事項】
1.芽孢染色用的菌種應控制菌齡，幼齡菌尚未形成芽孢，老齡菌芽孢囊破裂。
2.從試管中取菌液時，應先用接種環(huán)充分攪拌，然后再挑取菌液，否則菌體沉于管底，涂片時菌體太少。
3.對芽孢進行孔雀綠染色后，一定要等玻片冷卻后方可用水沖洗。
【思考題】
1.芽孢染色法為什么需要加熱？加熱染色時為什么必須維持在染液微冒蒸汽的狀態(tài)？
2.脫色反應中，為什么必須用緩流自來水沖洗？
實驗4細菌的鞭毛染色及運動性觀察
【實驗原理】
鞭毛是細菌的運動“器官”，細菌是否具有鞭毛，以及鞭毛著生位置和數(shù)目是細菌分類鑒定的重要依據(jù)之一。細菌的鞭毛一般都很纖細，其直徑通常為10～20nm，除了很少數(shù)能形成鞭毛束（由許多根鞭毛構成）的細菌可以用相差顯微鏡直接觀察到鞭毛束的存在外，細菌的鞭毛一般均不能用光學顯微鏡直接觀察到，而只能用電子顯微鏡觀察。光學顯微鏡觀察細菌鞭毛，必須用鞭毛染色法。
鞭毛染色方法很多，但其基本原理相同，即在染色前先用媒染劑處理，使它沉積在鞭毛上，從而使鞭毛直徑加粗，然后再進行染色。常用的媒染劑由單寧酸和氯化高鐵或鉀明礬等配制而成。本實驗主要介紹硝酸銀染色法和改良的Leifson染色法，前一種方法更容易掌握，但染色劑配制后保存期較短。
在顯微鏡下觀察細菌的運動性，可以初步判斷細菌是否具有鞭毛。通常使用壓滴法或懸滴法觀察細菌的運動性。與鞭毛染色法相比，該方法可以較快速、簡便地判斷細菌是否具有鞭毛。觀察時，要適當減弱光強度以增強反差，若光線太強，細菌和周圍的液體難以區(qū)分。
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