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《全國高等院校醫(yī)學(xué)實(shí)驗專業(yè)實(shí)驗教學(xué)規(guī)劃教材:臨床血液學(xué)檢驗實(shí)驗指導(dǎo)》是全國高等院校醫(yī)學(xué)檢驗專業(yè)實(shí)驗教學(xué)規(guī)劃教材之一，全書分兩篇五章共49個實(shí)驗。第一章至第四章為臨床血液學(xué)檢驗技術(shù)及驗證性實(shí)驗篇，從檢驗與臨床相結(jié)合的角度出發(fā)，按紅細(xì)胞疾病、白細(xì)胞疾病、出血與血栓性疾病順序較系統(tǒng)介紹血液病的實(shí)驗分類、特征與應(yīng)用，闡述了臨床血液學(xué)檢驗對血液疾病診治的重要性，能使學(xué)生從整體上了解實(shí)驗診斷對血液系統(tǒng)疾病及相關(guān)疾病診治的意義。尤其是血細(xì)胞形態(tài)學(xué)的檢驗部分，病例真實(shí)生動，圖文并茂，特別有助于學(xué)生把臨床血液學(xué)檢驗與臨床診斷相結(jié)合，對學(xué)生掌握本學(xué)科的基本知識、基本技能和指導(dǎo)今后的臨床工作具有參考價值。第五章為血液學(xué)檢驗綜合性及設(shè)計性實(shí)驗篇，包括兩個綜合性實(shí)驗（溶血性貧血的實(shí)驗室診斷和急性白血病的MICM分型診斷）及一個設(shè)計性實(shí)驗（DIC的實(shí)驗診斷），旨在培養(yǎng)學(xué)生綜合運(yùn)用所學(xué)本專業(yè)知識、實(shí)驗方法及實(shí)驗技能的能力。

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第一篇臨床血液學(xué)檢驗實(shí)驗技術(shù)及驗證性實(shí)驗
第一章骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢驗的基本方法
骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查是臨床檢驗的基本項目之一，通過觀察骨髓中造血細(xì)胞及外周血中血細(xì)胞形態(tài)和數(shù)量的變化、異常細(xì)胞和寄生蟲的有無等，診斷或協(xié)助診斷血液系統(tǒng)疾病、評價療效和預(yù)后。作為臨床血液學(xué)檢驗的重要內(nèi)容之一，骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查是醫(yī)學(xué)檢驗專業(yè)學(xué)生必須掌握的檢驗技術(shù)。
第一節(jié) 骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢驗實(shí)驗
一骨髓涂片制備及染色技術(shù)
【實(shí)驗?zāi)康摹?/span>
（1）掌握瑞氏染色方法和注意事項。
（2）掌握瑞氏染液的原理。
（3）熟悉骨髓細(xì)胞涂片的制備方法。
【實(shí)驗原理】
瑞氏染料由酸性伊紅和堿性亞甲藍(lán)組成，當(dāng)其溶解于甲醇后能解離成為帶負(fù)電的伊紅和帶正電的亞甲藍(lán)離子。細(xì)胞核中核酸和蛋白質(zhì)以及原始細(xì)胞的胞質(zhì)等嗜堿性物質(zhì)可與亞甲藍(lán)起作用而被染成藍(lán)色，胞質(zhì)中的血紅蛋白及嗜酸性顆粒等嗜酸性物質(zhì)可與伊紅起作用而被染成粉紅色。中性顆粒為中性物質(zhì)，可與伊紅和亞甲藍(lán)結(jié)合呈淡紫紅色；各種血細(xì)胞由于其所含化學(xué)成分不同對染料的結(jié)合力不同，染色后可呈現(xiàn)不同的染色特點(diǎn)。
【實(shí)驗器材】
1.試劑
（1）瑞氏染液：1g瑞氏粉（研磨成粉沫狀）加入500ml甲醇液中，再加入甘油約10ml，蓋緊蓋子，1周內(nèi)每天顛倒混勻數(shù)次，待瑞氏染料完全溶解后室溫放置（半年后效果最佳），可保存數(shù)年。
（2）pH6.8磷酸鹽緩沖液：取1%無水磷酸二氫鉀溶液30ml和1%無水磷酸氫二鈉溶液20ml，放入燒杯中加蒸餾水至1000ml，用玻璃棒攪拌，待完全溶解后，放入試劑瓶中，蓋緊蓋子4℃冰箱保存。
2.器材顯微鏡、洗耳球、玻璃棒、試劑瓶、載玻片。
【實(shí)驗步驟】
1.涂片制備
（1）玻片的制備：選擇干凈的玻片，用紗布擦凈后備用。
（2）涂片方法：取適量血液或骨髓液置于玻片的一端，將推片放在血滴上，待血滴散開后進(jìn)行推片，要求推片與載玻片呈30°～45°。
2.瑞氏染色
（1）標(biāo)記：待骨髓片和血片自然干燥后，選擇取材好（有骨髓小粒）和涂片好的骨髓片、血涂片各一張，用鉛筆在血膜頂端標(biāo)記病人的姓名和標(biāo)本來源。
（2）染色步驟：將骨髓片和血涂片血膜面朝上放平滴加瑞氏染液數(shù)滴覆蓋血膜30～60s按瑞氏染液和緩沖液的比例1:1.5滴加緩沖液洗耳球吹混勻染色約20min 低倍鏡下觀察有核細(xì)胞核質(zhì)界限清晰即可蒸餾水輕沖洗自然干燥，鏡檢【實(shí)驗結(jié)果】（1）成熟紅細(xì)胞染為橘紅色。
（2）淋巴細(xì)胞胞質(zhì)為天藍(lán)色。
（3）原始階段細(xì)胞染色質(zhì)結(jié)構(gòu)清晰。
【注意事項】
（1）玻片必須潔凈干燥，不能有水滴和雜質(zhì)，需使用推玻片制片。
（2）末梢血或骨髓液滴在載玻片后應(yīng)立即進(jìn)行涂片，否則會迅速凝固；髓或血滴不宜太大，且推片時應(yīng)有一定的角度；片子太長或太厚都會影響觀察。
（3）涂片的速度應(yīng)適中，速度過快，涂片會過厚；速度太慢，涂片則太薄。
（4）選擇骨髓標(biāo)本外觀有骨髓小粒、兩邊有空隙、長短適中、厚薄適宜做瑞氏染色最佳；做特殊染色標(biāo)本關(guān)鍵要厚薄適宜，根據(jù)病情選擇項目。如單純性貧血時需做鐵染色，慢性粒細(xì)胞白血病時需做中性粒細(xì)胞堿性磷酸酶染色，急性白血病時需做過氧化物酶染色、糖原染色、酯酶染色等。
（5）染色時間受細(xì)胞多少和室溫影響，如果細(xì)胞過多或室溫過低要增加染色時間，反之則減少染色時間，最好在低倍鏡下觀察有核細(xì)胞核、漿界限清晰時再沖洗。
（6）染色好標(biāo)本背景應(yīng)該干凈，細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，成熟紅細(xì)胞為橘紅色或淡紅色。
（7）做特殊染色時，玻片最好先處理。
1）無劃痕新玻片用清潔液清洗，水洗凈擦干。
2）放入50%的鹽酸溶液中浸泡24小時取出，用蒸餾水反復(fù)洗滌，晾干。
3）浸泡于95%的乙醇溶液中24小時取出，用蒸餾水反復(fù)洗滌，晾干備用。
（8）所用試劑均用分析純。
（9）與形態(tài)相關(guān)章節(jié)的實(shí)驗方法均參照本實(shí)驗流程執(zhí)行。
【臨床意義】
（1）外周血細(xì)胞數(shù)量、成分異常時通過瑞氏染色能觀察細(xì)胞形態(tài)并判斷疾病的性質(zhì)。
（2）血液系統(tǒng)相關(guān)性疾病抽取骨髓液涂片后，用瑞氏染色可判斷疾病性質(zhì)。
【方法學(xué)評價】
（1）瑞氏染色與瑞氏-姬姆薩染色相比較是最簡便、最快捷的方法。
（2）瑞氏染色能夠清楚地觀察細(xì)胞的微細(xì)結(jié)構(gòu)，如原始粒細(xì)胞和原始淋巴細(xì)胞的區(qū)別，前者為細(xì)粒狀，后為粗粒狀。
【思考題】
（1）瑞氏染色的步驟有哪些？
（2）染色過程中應(yīng)注意哪些事項？
實(shí)驗二骨髓紅細(xì)胞系各期細(xì)胞形態(tài)觀察
紅細(xì)胞系是骨髓造血系統(tǒng)之一，該系統(tǒng)占正常骨髓的20%～30%，劃分時主要掌握細(xì)胞核染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、胞質(zhì)顏色。在病理情況下，紅細(xì)胞系比值和形態(tài)會發(fā)生相應(yīng)改變。
【實(shí)驗?zāi)康摹?/span>
（1）掌握紅細(xì)胞系形態(tài)總特征。
（2）掌握正常紅細(xì)胞系各階段細(xì)胞形態(tài)。
（3）掌握骨髓紅細(xì)胞系與其他系細(xì)胞鑒別要點(diǎn)。
【實(shí)驗器材】
正常骨髓涂片、顯微鏡。
【實(shí)驗步驟】
（1）取一張骨髓片置于顯微鏡載物臺上。
（2）選擇厚薄適宜、分布均勻、成熟紅細(xì)胞排列緊密但不重疊、細(xì)胞形態(tài)完整區(qū)域。
（3）在油鏡下辨認(rèn)細(xì)胞并畫圖。
【實(shí)驗內(nèi)容】
1.紅細(xì)胞系細(xì)胞發(fā)育的形態(tài)總特征
（1）胞體：原始紅細(xì)胞到成熟紅細(xì)胞由大到小，圓形或類圓形。
（2）胞質(zhì)：顏色改變。不透明深藍(lán)色→灰藍(lán)色→暗灰色或藍(lán)綠色→粉紅色，與血紅蛋白（Hb）生成量有關(guān)。
胞質(zhì)量由少到多。
胞質(zhì)中無顆粒。
（3）胞核：核形呈圓形，居中；成熟紅細(xì)胞無核。
核染色質(zhì)從串珠狀→聚集→細(xì)塊狀→大塊狀。
核仁從有到無。
2.紅細(xì)胞系各階段細(xì)胞形態(tài)特點(diǎn) 見圖1-1和表1-1。
3.紅細(xì)胞系與其他系細(xì)胞區(qū)別要點(diǎn)
（1）幼稚紅細(xì)胞副染色質(zhì)明顯，而淋巴細(xì)胞副染色質(zhì)不明顯；幼稚紅細(xì)胞有Hb，呈多嗜性（圖1-2）。
（2）漿細(xì)胞核偏位，有時胞質(zhì)可見少許嗜天青顆粒，有泡沫感；而幼稚紅細(xì)胞核居中，胞質(zhì)中無顆粒。
【注意事項】
（1）骨髓片的選擇：選擇厚薄適宜、分布均勻、成熟紅細(xì)胞排列緊密但不重疊、細(xì)胞形態(tài)完整。
（2）辨認(rèn)細(xì)胞時，應(yīng)先全片觀察標(biāo)本染色，各系統(tǒng)細(xì)胞發(fā)育情況，并調(diào)節(jié)顯微鏡細(xì)螺旋看清細(xì)胞細(xì)微結(jié)構(gòu)。
（3）觀察細(xì)胞包括：胞體大小、形態(tài)、胞質(zhì)量、胞質(zhì)著色、顆粒有無、核形、核染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、核仁有無、核位置等。
（4）介于兩個階段之間細(xì)胞劃入下一階段。
（5）晚幼紅脫核后呈橘紅色微帶藍(lán)色，成熟紅細(xì)胞染色好壞為判斷染色的主要標(biāo)準(zhǔn)。
【臨床意義】
（1）正常骨髓中紅細(xì)胞系占20%～30%，原始紅細(xì)胞＜1%，早幼紅細(xì)胞＜5%，中、晚幼紅細(xì)胞各占10%。
（2）在缺鐵性貧血、巨幼細(xì)胞貧血時紅細(xì)胞系增生可＞30%，溶血性貧血時紅細(xì)胞系增生旺盛。
（3）在骨髓增生異常綜合征和紅白血病時紅細(xì)胞系增生多達(dá)50%以上并伴隨形態(tài)改變。
【思考題】
（1）紅細(xì)胞系細(xì)胞形態(tài)的主要特點(diǎn)有哪些？
（2）如何區(qū)別中幼紅細(xì)胞和晚幼紅細(xì)胞？
實(shí)驗三骨髓粒細(xì)胞系各期細(xì)胞形態(tài)觀察
粒細(xì)胞系是骨髓造血系統(tǒng)之一，該系占正常骨髓的40%～60%，劃分時要掌握細(xì)胞核染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、核形變化、胞質(zhì)中顆粒有無及性質(zhì)。在病理情況下粒細(xì)胞系比值和形態(tài)會發(fā)生相應(yīng)改變。
【實(shí)驗?zāi)康摹?/span>
（1）掌握骨髓粒細(xì)胞系各期細(xì)胞形態(tài)特點(diǎn)。
（2）熟悉粒細(xì)胞系與其他系細(xì)胞鑒別要點(diǎn)。
【實(shí)驗器材】
正常骨髓涂片，顯微鏡。
【實(shí)驗步驟】
（1）取一張大致正常骨髓片，置于顯微鏡載物臺上。
（2）低倍鏡找到體尾交界處或分布均勻的區(qū)域。
（3）在油鏡下辨認(rèn)細(xì)胞階段并畫圖。
【實(shí)驗內(nèi)容】
1.粒細(xì)胞系細(xì)胞發(fā)育的形態(tài)總特征（從原始到成熟階段）
（1）胞體：由大到小，但早幼粒較原始粒細(xì)胞胞體大。
（2）胞質(zhì)：量由少到多。
水彩藍(lán)→藍(lán)色→紅色。
胞質(zhì)中顆粒由無顆�！翘禺愋灶w粒出現(xiàn)→特異性顆粒出現(xiàn)。
特異性顆粒分三種：中性顆粒、嗜酸性顆粒、嗜堿性顆粒。
中性顆粒：粒細(xì)胞系細(xì)胞胞質(zhì)中充滿大小均勻，分布一致，染淡紅色顆粒。
嗜酸性顆粒：粒細(xì)胞系細(xì)胞胞質(zhì)中充滿大小均勻，分布一致，有折光感，猶如剝開石榴，呈橘黃色顆粒。
嗜堿性顆粒：粒細(xì)胞系細(xì)胞胞質(zhì)中和（或）核上有多少不一，大小不等，呈黑色顆粒。嗜堿粒細(xì)胞由于胞體較小，顆粒常分布在胞核上，不易劃分階段。
（3）胞核：核形變化從圓形→橢圓形→一側(cè)扁平→凹陷或腎形→桿狀→分葉。
核染色質(zhì)由細(xì)砂狀→粗顆粒狀→塊狀。
核仁從有到無。
2.粒細(xì)胞系各階段細(xì)胞形態(tài)學(xué)特點(diǎn) 見圖1-3和表1-2。
3.粒細(xì)胞系與其他系細(xì)胞區(qū)別要點(diǎn)
（1）原始粒細(xì)胞和早幼粒細(xì)胞鑒別要點(diǎn)（表1-3）。
（2）中、晚幼稚粒細(xì)胞與單核細(xì)胞比較，前者胞質(zhì)顆粒呈淡紅色，后者胞質(zhì)呈灰紅色，有細(xì)小的紫紅色顆粒（圖1-4）。
（3）粒細(xì)胞系和紅細(xì)胞系最主要的鑒別要點(diǎn)是粒細(xì)胞系細(xì)胞質(zhì)有顆粒；紅細(xì)胞系細(xì)胞質(zhì)無顆粒，核為圓形。
【注意事項】
（1）各階段粒細(xì)胞劃分主要根據(jù)：細(xì)胞核染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、胞質(zhì)顆粒性質(zhì)和核形變化。
（2）較成熟原始粒細(xì)胞和早幼粒細(xì)胞的區(qū)別要點(diǎn)是胞質(zhì)中的嗜天青顆粒多少，如果胞質(zhì)中出現(xiàn)較多的嗜天青顆粒即為早幼粒細(xì)胞，如果少量嗜天青顆粒為原始粒細(xì)胞。
（3）注意嗜堿粒細(xì)胞與組織嗜堿細(xì)胞鑒別，后者胞體呈梭形或不規(guī)則形，顆粒較粗大并充滿胞質(zhì)中，甚至覆蓋于核上。
（4）粒細(xì)胞系中幼以下階段細(xì)胞的劃分以核形變化為準(zhǔn)；中幼粒細(xì)胞與晚幼粒細(xì)胞之間的區(qū)別主要是后者核有凹陷；晚幼粒細(xì)胞與桿狀核粒細(xì)胞的劃分標(biāo)準(zhǔn)為核的凹陷程度與假設(shè)核直徑之比，若該比值小于1/2為晚幼粒細(xì)胞，大于1/2為桿狀核粒細(xì)胞；桿狀核粒細(xì)胞與分葉核粒細(xì)胞劃分標(biāo)準(zhǔn)是核最窄處與核最寬處的比例，如果在1/3以下為分葉核。

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